Doktorand am Lehrstuhl für Fermentationstechnik
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Jan-Philipp Schwarzhans, Master of Science der Molekularen Biotechnologie
Tel +49 (0)5 21 - 106-5287 (Büro)
Fax +49 (0)5 21 - 106-6475 (Sekretariat)
Email: jsc@fermtech.techfak.uni-bielefeld.de
Wissenschaftlicher Werdegang:
06/2006 Allgemeine Hochschulreife am Waldörfer Gymnasium in Hamburg
10/2007-09/2010 Bachelor of Science der Molekularen Biotechnologie an der Universität Bielefeld
10/2010-4/2013 Master of Science der Molekularen Biotechnologie an der Universität Bielefeld
Spezialisierung mit praktischer Vertiefung
04/2011-11/2011 Teil des Studententeams "Bielefeld University" im iGEM 2011-Wettbewerb, organisiert vom MIT in Boston
04/2012-03/2013 Masterarbeit in der AG Fermentationstechnik zum Thema "Herstellung verschiedener Hochwertprodukte mit Euglena gracilis und Galdieria sulphuraria im Rahmen eines Bioraffineriekonzeptes"
seit 05/2013 Doktorand in der AG Fermentationstechnik als Promotionsstipendiat des CLIB-Graduate Cluster Industrial Biotechnology an der Universität Bielefeld
Forschungsgebiet:
Multiple und gerichtete Integration von Expressionskassetten für rekombinante Proteine in das Genom von Pichia pastoris
Pichia pastoris ist ein industriell etablierter und vielfach eingesetzter Produktionsorganismus für rekombinante Proteine. Die Expressionskassette wird, zusammen mit einem Selektionsmarker wie z.B. einer Zeocinresistenz, über homologe Rekombination in das Genom integriert. Der Locus der Integration kann mittels der flankierenden 5‘-UTR und 3‘-UTR der Expressionskassette bestimmt werden. Bei einer erfolgreichen Integration ersetzt die Expressionskassette das AOX1-Gen und der Klon zeigt den Phänotyp mutS (slow methanol utilization). Oftmals entstehen jedoch Klone, die den Phänotyp des Selektionsmarkers und zugleich ein intaktes AOX1-Gen (Phänotyp mut+) besitzen. Dies bedeutet, dass die Kassette zufällig integrierte. Auch kann die Kassette mehrmals integriert werden, was zu einer höheren Genkopienzahl und im Idealfall höherer Produktivität führt.
Ziel des Projektes ist die Analyse der zufälligen Integration und die Erhöhung der Kopienzahl der Expressionskassette im Genom. Hierfür muss der Integrationslocus und die Kopienzahl einer ausreichenden Menge Klone vom mutS- und mut+-Typ mittels Inverse-PCR-Klonierung, Sequenzierung und qRT-PCR untersucht werden. Auf diese Weise kann aufgeklärt werden, ob bevorzugte Loci existieren und die Länge oder Sequenz der 5‘-UTR und 3‘-UTR den Integrationslocus beeinflussen. Die Kopienzahl der Expressionskassette könnte über mehrfache Transformation erhöht werden. Für die Realisation dieses Ansatzes wäre die Entfernung des integrierten Selektionsmarkers notwendig, um stets eine Kassette mit dem gleichen Selektionsmarker verwenden zu können. Ein solcher Knockout könnte mittels des Cre-loxP-Systems durchgeführt werden. Nach dem Knockout kann in einer neuen Transformationsrunde ein anderer geeigneter Locus für die Integration gewählt werden. Dies sollte die Generierung von Klonen mit erhöhter Kopienzahl und hoffentlich verbesserter Produktivität des rekombinanten Proteins ermöglichen. Durch die Genomsequenzierung von hoch produktiven Klonen können zeitgleich Fragen in Bezug auf den Integrationslocus und die Kopienzahl beantwortet werden.